+7 (495) 728-15-87
Выявление бактериальных эндотоксинов относится к ключевым вопросом безопасности и качества в фармацевтической и медицинской промышленности. Важность бактериальных эндотоксинов заключается в том, что они являются пирогенами. К пирогенам относятся разнообразные группы соединений, определяемые их способностью вызывать быстрое повышение температуры тела при их введении в кровоток («Pyro» происходит от греческого слова, обозначающего огонь).
Наличие пирогенов может привести к быстрой воспалительной реакции и сильному шоку, за которым в некоторых случаях следует отказ органов и в конечном итоге смерть. Очевидно, что присутствие пирогенов в любом инъекционном фармацевтическом препарате или на поверхностях медицинских изделий, которые будут контактировать с циркулирующей кровью или спинномозговой жидкостью, является потенциальной опасностью, и важно иметь возможность протестировать широкий спектр продукции на наличие этих соединений. Бактериальные эндотоксины, безусловно, являются наиболее распространенным пирогеном и наиболее вероятно будет обнаружен в производственной среде, поэтому тестирование фокусируется на методах его обнаружения.
Термин бактериальные эндотоксины близок липополисахариду (ЛПС/LPS), который является основным компонентом наружного слоя клеточной стенки у грамотрицательных бактерий. Грамотрицательная клеточная стенка более сложна, чем у грамположительных бактерий, и имеет внешнюю мембрану или оболочку, состоящую из ЛПС. Она действует как барьер проницаемости для клетки и также важнадляформирования биопленок и улавливания макромолекул из окружающей среды.
При грамотрицательном бактериальном сепсисе высвобождение пирогенных ЛПС вызывает выделение большого количества воспалительных цитокинов, что может привести к токсическому шоку. Грамотрицательные бактерии постоянно синтезируют ЛПС, чтобы заменить потери с поверхности клетки, и когда клетки умирают, они высвобождают ЛПС из клеточной стенки. Это означает, что свободные ЛПС всегда будут присутствовать в среде, содержащей грамотрицательные виды. Грамположительные бактерии, напротив, не выделяют внеклеточные ЛПС.
Поэтому важно контролировать рост грамотрицательных видов в воде, в других сырьевых материалах и в производственной среде, чтобы предотвратить производство пирогенов. Однако отсутствие грамотрицательных бактерий не означает отсутствия пирогенов. ЛПС является очень стабильным веществом и не разрушается нагреванием или другими средствами. Он может сохраняться очень долго в жидкостях и на сухих поверхностях при отсутствии жизнеспособных бактерий. Это значит, что тесты, специально разработанные для выявления эндотоксина/ЛПС, необходимы для демонстрации безопасности фармацевтических и медицинских изделий.
Метод обнаружения
Первым методом, широко используемым для обнаружения эндотоксина в фармацевтических препаратах, был пирогенный тест на кролике, первоначально описанный в 1925 году. Этот метод включает в себя инъекции кроликам тестируемой жидкости, а затем наблюдение за ними на предмет любого повышения температуры тела и симптомов лихорадки. Данный метод используется при определении пирогенности, согласно ГОСТ ISO 10993-11-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 11. Исследования общетоксического действия» и ОФС.1.2.4.0005.15 «Пирогенность». Пирогенный тест на кролике является одновременно трудоемким и дорогостоящим для выполнения и не может быть количественным. Его применение также ограничено продуктами, которые не вызывают побочных эффектов у подопытных животных. Этот тест по-прежнему одобрен в качестве метода обнаружения пирогенов, но в настоящее время используется редко, поскольку он был в значительной степени заменен лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus Amebocyte Lysate) или LAL-тестом.
LAL-тест берет свое начало в открытии 50-х годов прошлого века, демонстрирующим, что кровь Атлантического мечехвоста (Limulus polyphemus) образует сгустки в присутствии бактериального эндотоксина. Позже было установлено, что эта реакция вызвана фактором свертывания, содержащимся в гранулах подвижных клеток крови, называемых амебоцитами. Фактор свертывания высвобождается в кровь из клеткив качестве защиты от инфекции, когда обнаруживается эндотоксин. Наличие даже очень низких уровней бактериального эндотоксина запускает «коагуляционный каскад» реакций, включающий ряд ферментов сериновой протеазы и приводящий к образованию тромба (сгустка)коагулинового геля. Эта реакция была превращена в чувствительный тест на эндотоксин путем сбора амебоцитов из крови мечехвостов и последующего лизирования клеток с получением реагента, содержащего фактор свертывания – лизатамебоцитов мечехвоста.
Были разработаны три основных LAL-метода: гель-тромб, хромогенный и турбидиметрический. Метод гель-тромб может быть положен в основу очень простого метода детектирования путем добавления реагента к образцу в пробирке и инкубации при 37°C в течение одного часа. Если тромб (сгусток) виден при инверсии трубки, то результат положительный. Это метод конечной точки, и его можно сделать полуколичественным путем тестирования последовательных разведений. Результаты выражаются в единицах эндотоксина (EU), что является мерой эффективности эндотоксина, а не его количества. Это отражает вариабельность токсичности природных ЛПС. Хромогенный метод использует синтетический субстрат, который меняет цвет, когда он расщепляется эндотоксин-активированной протеазой, в то время как турбидиметрический метод опирается на развивающийся сгусток коагулинового геля, изменяющий мутность образца. Оба метода могут быть использованы в качестве количественных кинетических методов путем построения стандартных кривых времени начала воздействия на концентрацию эндотоксина. Спектрофотометрические приборы могут обнаруживать изменения мутности или цвета при гораздо более низких концентрациях эндотоксина, чем те, которые необходимы для образования видимого тромба (сгустка) геля, что делает хромогенные и турбидиметрические методы гораздо более чувствительными, чем метод геля-тромб. Чувствительность определяется самой низкой концентрацией на стандартной кривой.
LAL-тест в настоящее время является стандартным методом тестирования бактериальных эндотоксинов парентеральных лекарственных препаратов и медицинских изделий и определяется как гармонизированный метод в фармакопеях США, Европы, Японии и России (USP chapter 85, EP 2.6.14 Supplement 6.6, JP General Test 4.01, ОФС.1.2.4.0006.15 «Бактериальные эндотоксины»). Можно использовать любой из трех методов, но эталонным методом в случае возникновения каких-либо споров является предельный тест геля-тромб. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) также опубликовало детальное руководство по тестированию бактериальных эндотоксинов и пирогенов для фармацевтической и медицинской промышленности в 2012 году.
Оно включает в себя информацию о планах отбора проб, хранении образцов, валидации альтернативных тестов на бактериальные эндотоксины и предпочтительном использовании количественных тестов в программах качества по дизайну (QBD). При проведении тестирования на бактериальные эндотоксины необходимо учитывать ряд важных моментов. Один из них заключается в том, чтобы обеспечить использование во время тестирования лабораторного оборудования и реагентов без пирогенов для избегания ложноположительных результатов. Медицинские изделия обычно проверяются путем промывки поверхности стандартным объемом специально подготовленной апирогенной воды или подходящим растворителем. Ряд факторов может помешать проведению теста, воздействуя либо на бактериальный эндотоксин, либо на LAL-реагент. Примеры включают рН, концентрацию белка и наличие примесей химических веществ в парентеральных препаратах или в их смывах. Интерференция может привести к неспособности обнаружить бактериальные эндотоксины, и поэтому очень важно его идентифицировать. Лучше всего это сделать с помощью образцов положительного контроля, в которые добавлен подходящий эталонный стандарт бактериального эндотоксина или сертифицированный стандарт.
Существует широкий спектр коммерческих тестовых продуктов, основанных на LAL-методологии, которые ориентированы на удобство и простоту использования. Реактивы для гель-тромб, хромогенных и турбидиметрических испытаний – все они доступны, оптимизированы для конкретного метода и поставляются в лиофилизированной форме с подложками и буферами, готовыми к восстановлению перед использованием. Реагенты выпускаются в количествах, пригодных для одиночных испытаний, для многократных испытаний или навалом для лабораторий, работающих с большим количеством образцов.
Простые тесты на тромб геля могут быть проведены с минимальным оборудованием, в то время как кинетические тесты, по крайней мере, требуют спектрофотометра. Многие коммерческие реагенты теперь предназначены для использования в формате микропланшетов. Степень автоматизации может быть достигнута с помощью считывателей инкубационных пластин, оснащенных программным обеспечением, предназначенным для проведения анализа бактериальных эндотоксинов, таким как Endoscan-V ™ от Charles River.
Сокращение времени, затрачиваемого на выполнение тестов, является меньшей проблемой для определения бактериальных эндотоксинов, чем для других микробиологических анализов, поскольку стандартный метод занимает немногим более часа. Тем не менее, быстрые тесты были разработаны и доступны на коммерческой основе. Одним из примеров является система Charles River Endosafe®-PTS ™, основанная на кинетической хромогенной методике с точным количеством LAL-реагента, хромогенного субстрата и контрольного бактериального эндотоксина, предварительно загруженного в четырехканальный картридж. Картридж помещается в ручной считыватель, а затем образец добавляется в четыре лунки на одном конце, прежде чем быть вытянутым через каналы, содержащие реагенты. Результаты доступны примерно через 15 минут, и система предназначена для тестирования на месте использования. Система Endosafe® -MCS с несколькими картриджами, использующая ту же технологию, также доступна для тестирования нескольких образцов в лабораторных условиях, в то время как Endosafe® Nexus ™ - это полностью автоматизированная роботизированная система, подходящая для тестирования большого объема воды. Другой подход был принят компанией Highland Biosciences, которая разработала систему Pyro Xpress™. При этом также используются картриджи, которые могут быть предварительно загружены реагентами или принимать реагенты, поставляемые пользователем. Она основана на простой, недорогой методике гель-тромб и использует технологию «многолучевого резонатора» в блоке считывания, который может выдавать результаты всего за пять минут, а также способен предоставлять кинетические данные.
Хотя LAL-тест остается стандартным методом для тестирования бактериальных эндотоксинов, существуют опасения по поводу некоторых аспектов этого метода, которые привели к разработке альтернатив. Например, коммерческие партии лизата могут отличаться по своей чувствительности к бактериальным эндотоксинам, а также по своей специфичности. Но потенциально более серьезной проблемой является сокращение запасов мечехвостов. В то время как кровь этих существ может быть собрана без ущерба для животного, другие экологические нагрузки приводят к тому, что дикая популяция становится под угрозой исчезновения. Отсутствие необходимости собирать их кровь для производства LAL, безусловно, поможет в их сохранении. Многое уже было достигнуто за счет сокращения количества LAL-реагента, необходимого для проведения анализов, но методология все еще опирается на достаточный запас мечехвостов и в конечном счете может оказаться неустойчивой.
Одним из решений этой проблемы является разработка методов тестирования с использованием рекомбинантного фактора С (recombinant Factor C/rFC), эндотоксин-чувствительного белка, который действует как праймер для каскадной реакции свертывания крови в LAL-тестах. Сложная генная инженерия позволила создать высокочувствительный rFC, который может быть использован в качестве основы альтернативного метода тестирования бактериальных эндотоксинов, не зависящего от мечехвостов. Это было превращено в коммерческие тестовые продукты, в частности в систему Pyrogen™ , поставляемую компанией Lonza. Пироген – это анализ конечной точки на основе rFC, который активируется бактериальными эндотоксинами и затем расщепляет синтетический субстрат для высвобождения флуорогенного соединения. Он работает в формате микропланшета и занимает один час, чтобы получить количественный результат. Это говорит, что он более специфичен, чем традиционные LAL-анализы, и не подвержен ложным срабатываниям, вызванным глюканом, что может быть проблемой в LAL-тестах. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило тестирование бактериальных эндотоксинов на основе rFC для выпуска конечного продукта, при условии, что он должным образом проверен на соответствие эталонному тесту предела гель - тромба.
Еще одним альтернативным методом является тест на активацию моноцитов (monocyte-activation testing/MAT), который использует иммунную реакцию, обнаруженную в крови человека. Тест использует моноциты, которые активируются пирогенами, чтобы произвести воспалительный цитокин интерлейкин-1β (IL-1β), который затем может быть обнаружен с помощью анализа ELISA. Этот метод не является специфичным для бактериальных эндотоксинов, но также обнаруживает другие пирогены и одобрен EP в качестве альтернативы in vitro теста на пироген кролика. Это говорит, что он является лучшим индикатором реакции лихорадки человека на пирогены, чем LAL-тест, потому что он основан на иммунном ответе человека. MAT-тест был реализован в коммерческих продуктах, таких как система Pyro Detect, поставляемая компанией Merck Millipore.
Специалисты компании «СтериПак Сервис» помогут Вам с выбором метода тестирования, организацией и проведением лабораторных испытаний Вашего продукта на бактериальные эндотоксины и пирогенность. Вы можете оставить заявку на нашем сайте и мы оперативно свяжемся с Вами.